螢光物質具有特別的能階，當電子被光激發至這些能階時，會躍遷到一個次高的能階，再回到低能階，因此發出的光波長要比激發的波長更長（能量更低）。
傳統的螢光顯微術係利用螢光物質的這種特性，將正確波長的光子射入摻有螢光的樣本中，好對樣本進行觀察，只有吸附螢光的部份會發出更長波長的光子，因此便能把樣本與背景區分開來。
多光子螢光顯微術利用了二次激發的概念，用兩倍於正確波長的光子以透鏡聚焦，達到極高的強度後照射樣本，同時用兩個光子激發螢光物質。由於只有在光子匯聚處才會將螢光激發，這個方法便有高解析、立體顯微的效果，並且低波長的光具有更高的穿透能力，因此有潛力進行非侵入式（不用切開）的顯微照影。
光漂白現象是螢光顯微術一直以來的障礙，螢光分子在高強度的光持續照射下將會發生裂化，使得其螢光特性漸漸消失，因此樣本與背景的影像差異將減少，即對比度將大幅下降。
近來有研究[1]利用液晶與光子晶體改良了多光子螢光顯微術，此法能將光脈衝更進一步集中，一來減少了光漂白現象，二則使訊號增強了二十餘倍，加入液晶則進一步使得脈衝具有調控性。
註：具有次高能階，躍遷回低能階的時間大於10奈秒者稱為磷光，小則稱為螢光。
[1] 蕭宇成，增強多光子螢光訊號顯微鏡
